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湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司
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實(shí)驗(yàn)方案
1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)：(1)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因.(2)按連接步驟連接目的基因和載體,并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌.(3)篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落,提取質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜,DNA序列測(cè)定,確定無(wú)誤后進(jìn)行下一步.(4)如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL啟動(dòng)子,則在30-32℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí),使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6,迅速使溫度升至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3-5h;如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac等,則37℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加IPTG至終濃度為1mmol/L.繼續(xù)培養(yǎng)3-5h.(5)取上述培養(yǎng)液1mL,1000g離心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯Chemicalbook酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,作SDS-PAGE檢測(cè).
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化：細(xì)菌的裂解常用方法有：①高溫珠磨法;②高壓勻漿;③超聲破碎法;④酶溶法;⑤化學(xué)滲透等.前三種方法屬機(jī)械破碎法,并且方法①、②已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛.下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟.酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類有作用,而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著.主要步驟為：4℃,5000rpm離心,15min,收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液(100mL).棄上清,約每克濕菌加3mL裂解緩沖液,懸浮沉淀.
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