| 微納米氣泡富氫水機貼牌廠家超飽和納米氣泡富氫低氘水機代工供氫器富氫水機 |
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氫氧混合生產廠家
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| 氫氣預防人工皮膚UVA老化的轉錄組學評估 目 的 間歇性吸入氫氣可通過減輕氧化應激，從而預防長波紫外線（UVA）誘導的皮膚光老化，但其分子機制尚不明確。此外，對于并非以發病機制為主要研究方向的課題，推薦采用動物實驗替代方案。本研究旨在利用人工皮膚短期體外體系，評估氫氣對UVA誘導光老化的預防作用。 方 法 將人工皮膚分別以0、7、10.5 J/cm?/天的劑量進行UVA照射，隨后置于含或不含1.3%氫氣的CO?培養箱中培養1天。該循環重復3次，再繼續培養1天，隨后開展轉錄組學與組織學分析。 結 果 7 J/cm?/天的UVA僅引起表皮形態輕微改變，但可顯著誘導光老化相關轉錄組變化；而10.5 J/cm?/天的UVA則導致表皮發育不全、細胞過度凋亡，且轉錄組變化有限。對比7 J/cm?/天照射下加氫氣與不加氫氣組發現，氫氣可調控UVA誘導的生物學過程與信號通路，包括NRF2介導通路、NFκB1–RelA介導通路，并抑制p53介導的細胞衰老通路。 結 論 本研究證實，在較低劑量UVA（7 J/cm?/天，總劑量21 J/cm?）照射下，人工皮膚僅出現輕微組織學改變，但可檢測到光老化相關轉錄組變化。此外，氫氣可通過皮膚表面滲透，對UVA誘導的細胞應激與衰老發揮保護作用，提示其在預防光老化方面具有潛在價值。本研究為未來氫氣防治UVA誘導光老化的轉化研究提供了初步實驗依據。 1 引言 分子氫因可通過減輕氧化應激，對缺血再灌注損傷等疾病發揮有益作用而備受關注，長期攝入也可能促進健康。氫氣可選擇性清除羥自由基（?OH）等高活性活性氧（ROS），并調控核因子E2相關因子2（NRF2）、核因子κB（NF-κB）等氧化應激相關基因。 日光中含量豐富的長波紫外線（UVA，320～400 nm）可穿透表皮與真皮層，通過誘導活性氧生成，引發深皺紋、皮膚松弛、粗糙、色素沉著等光老化表現。在皮膚組織中，單線態氧（?O?）、超氧陰離子（O??）是UVA誘導的主要活性氧；其中?O?在光老化中起主導作用，由O??衍生的過氧化氫（H?O?）與?OH也參與其中。因此，減少UVA誘導的活性氧、調控光老化相關轉錄組應答，有助于預防光老化。 本團隊前期研究已證實，間歇性吸入1.3%氫氣可抑制小鼠模型中UVA誘導的光老化表型。另一方面，三維人工皮膚等體外皮膚替代物，已逐漸成為皮膚病學研究中替代動物實驗的重要工具。然而，該模型能否檢測光老化早期進展，以及氫氣對這些早期改變的作用，仍不明確。 本研究采用成熟的體外皮膚替代體系，結合轉錄組學與組織學分析，評估UVA誘導的光老化及氫氣的預防作用。 2 材料與方法 2.1 人工皮膚培養及UVA照射聯合氫氣處理 使用可通入1.3%氫氣的CO?培養箱，氣流由STEC PAC-P2系統調控。將人工皮膚置于無酚紅培養基中，在37℃、5% CO?條件下常規培養1天。 將人工皮膚隨機分為6組：無UVA照射（U0）、7 J/cm? UVA照射（U7）、10.5 J/cm? UVA照射（U10.5），各組再分為不加氫氣（?）與加1.3%氫氣（+）亞組。更換培養基后，在超凈工作臺中以UVA光源按設定劑量照射，隨后放回培養箱培養1天，該過程重復3次。最后再培養1天，用于后續轉錄組學與組織學檢測。 圖1 實驗分組與時間線 實驗分組依據UVA劑量（0、7、10.5 J/cm?）及是否暴露于1.3%氫氣劃分。樣本接受3輪UVA照射，每輪照射后培養1天（5% CO?，含或不含1.3%氫氣）。在轉錄組學與組織學分析前再額外培養1天。主圖中組織學分析使用U0_H2（?）、U7_H2（?）、U7_H2（+）組，RNA測序分析則包含所有組別。 2.2 組織學分析 末次UVA照射后，將人工皮膚繼續培養2天，用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、4 μm切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色；采用TUNEL試劑盒檢測凋亡細胞。免疫組化檢測增殖細胞核抗原（PCNA）、磷酸化組蛋白H2A.X（Ser139）、p53。抗體詳細信息見補充資料。 冰凍標本經O.C.T.包埋、6 μm切片，采用二氫乙錠（DHE）熒光染料檢測O??，用膠原蛋白雜交肽標記膠原降解。使用虛擬切片系統、共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡采集圖像，并用ImageJ軟件分析。 2.3 RNA測序（RNA?Seq）分析 末次UVA照射2天后，將人工皮膚迅速液氮冷凍并于?80℃保存。使用NucleoSpin RNA Plus試劑盒提取總RNA，經質控篩選RIN≥7.0的樣本建庫。采用Oxford Nanopore平臺進行納米孔測序，使用MinION測序儀完成測序。 使用Guppy進行堿基識別，Minimap2將序列比對至GRCh38.p14參考基因組。采用iDEP1.1云平臺分析差異表達基因（DEGs），設定FDR＜0.1、倍數變化≥2為篩選標準。基于差異基因進行KEGG富集分析與IPA通路分析。 2.4 實時熒光定量PCR 以總RNA為模板，采用一步法TB Green試劑盒進行qPCR，以GAPDH為內參，采用2^(-ΔΔCt)法計算相對表達量。引物信息見補充資料。 2.5 統計學分析 組織學與qPCR數據以平均值±標準誤表示，采用單因素方差分析（ANOVA）及Holm?Sidak事后檢驗，p＜0.05為差異具有統計學意義。RNA?seq采用DESeq2進行差異分析，使用Benjamini–Hochberg法校正p值，FDR＜0.1定義為差異表達基因。 3 結 果 3.1 UVA照射與氫氣對表皮形態的影響 預實驗顯示，10.5 J/cm?/天 UVA可誘導過度凋亡與表皮萎縮，因此重點觀察7 J/cm?/天 UVA及氫氣的作用。 U7組表皮上層可見核固縮，U0組與U7組表皮厚度無顯著差異，氫氣處理未顯著改變表皮厚度。各組凋亡細胞比例與PCNA陽性細胞比例無統計學差異，但U7組呈上升趨勢。 圖2 氫氣暴露對表皮變薄的影響 （a）HE染色人工皮膚光鏡圖；（b）表皮厚度定量分析；（c）TUNEL染色凋亡細胞；（d）凋亡細胞比例定量；（e）PCNA陽性增殖細胞免疫染色；（f）PCNA陽性細胞比例定量。 3.2 UVA照射與氫氣對差異表達基因及生物學功能的影響 RNA測序聚類分析明確鑒定出與皮膚功能相關的基因簇（簇5）。相同UVA劑量下對比顯示：U7+H?組與U7組間的差異基因數量最多。 與U0組相比，U7組中細胞應激損傷、炎癥、腫瘤相關通路顯著上調；而氫氣處理后，這些UVA誘導上調的通路顯著下調。 圖3 全局基因表達及皮膚功能相關通路分析 （a）全局基因表達熱圖；（b）簇5前10位富集通路；（c）各組差異基因數量；（d、e）經典通路氣泡圖；（f、g）IPA分析NRF2介導氧化應激通路。 PCA圖顯示樣本聚類，火山圖展示效應量與統計學顯著性。 3.3 氫氣對UVA照射人工皮膚NRF2介導氧化應激通路轉錄組的預測作用 聚焦氧化應激關鍵通路NRF2：與U0組相比，U7組NRF2信號及下游多數抗氧化相關基因顯著上調；而加入氫氣后，NRF2信號及下游抗氧化基因（SQSTM1、HMOX1、PRDX1、FTH1、GPX2、SOD、TXN、GSR、TXNRD1等）均下調。 3.4 細胞應激標志物O??、γH2AX與p53的檢測 DHE標記的O??主要分布于表皮，各組表皮O??水平無顯著差異。 γH2AX為氧化應激與細胞衰老相關DNA損傷標志物：與U0組相比，U7組γH2AX陽性細胞比例顯著升高，但氫氣處理組與未處理組無顯著差異。 p53核定位結果顯示：與U0組相比，U7組表皮p53陽性細胞核比例顯著升高；氫氣處理后該比例顯著降低。 圖4 氫氣對ROS介導DNA損傷及p53核定位的影響 （a）DHE標記O??；（b）熒光強度定量；（c）γH2AX免疫染色；（d）陽性細胞比例；（e）p53免疫染色；（f）陽性細胞比例。 4 討 論 本研究證實，間歇性1.3%氫氣處理可顯著改變UVA照射人工皮膚中光老化相關基因簇的轉錄組。 組織學上，7 J/cm?/天 UVA可同時促進凋亡與增殖，有助于維持表皮結構，氫氣在此條件下無明顯形態學影響；而10.5 J/cm?/天 UVA則導致表皮變薄、過度凋亡，提示UVA對表皮形態的影響呈劑量依賴性。人工皮膚模型與動物模型對UVA及氫氣的應答差異，可能與生物環境、氫氣遞送途徑有關：動物體內氫氣可經表皮滲透與全身循環作用，而人工皮膚僅能通過表皮滲透，且缺乏血管、神經與免疫細胞，無法完全模擬在體皮膚。 轉錄組分析顯示，7 J/cm?/天 UVA誘導的差異基因最多，氫氣可逆轉UVA上調的細胞應激、炎癥、腫瘤相關通路，同時激活DNA修復、氧化應激抑制相關通路；而高劑量10.5 J/cm?/天 UVA僅引起有限轉錄組改變。提示較低劑量UVA可在不造成明顯組織損傷的前提下，誘導顯著的光老化相關轉錄組應答。 盡管上游分析中NRF2活性預測無顯著差異，但氫氣可下調多數NRF2下游基因，同時抑制經典NFκB1?RelA通路，提示氫氣可通過調控NF?κB通路發揮抗光老化作用。 本研究中O??與γH2AX無組間差異，可能與樣本采集時間點有關；而氫氣可顯著降低p53核轉位，提示氫氣可能通過調控p53介導的衰老通路，預防UVA誘導的光老化。 5 結 論 本研究采用人工皮膚模型證實：在較低劑量UVA（7 J/cm?/天，總劑量21 J/cm?）照射下，皮膚僅出現輕微組織學改變，但可檢測到明顯的光老化相關轉錄組變化。氫氣可通過皮膚表面滲透，改善UVA誘導的細胞應激與衰老相關生物學過程，提示其在預防光老化方面具有潛在應用價值。本研究為未來氫氣防治UVA誘導光老化的轉化研究提供了初步實驗基礎 |
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