| 微納米氣泡富氫水機貼牌廠家超飽和納米氣泡富氫低氘水機代工供氫器富氫水機 |
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氫氧混合生產(chǎn)廠家
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| 氫氣預(yù)防人工皮膚UVA老化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)評估 目 的 間歇性吸入氫氣可通過減輕氧化應(yīng)激，從而預(yù)防長波紫外線（UVA）誘導(dǎo)的皮膚光老化，但其分子機制尚不明確。此外，對于并非以發(fā)病機制為主要研究方向的課題，推薦采用動物實驗替代方案。本研究旨在利用人工皮膚短期體外體系，評估氫氣對UVA誘導(dǎo)光老化的預(yù)防作用。 方 法 將人工皮膚分別以0、7、10.5 J/cm?/天的劑量進行UVA照射，隨后置于含或不含1.3%氫氣的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。該循環(huán)重復(fù)3次，再繼續(xù)培養(yǎng)1天，隨后開展轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)分析。 結(jié) 果 7 J/cm?/天的UVA僅引起表皮形態(tài)輕微改變，但可顯著誘導(dǎo)光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化；而10.5 J/cm?/天的UVA則導(dǎo)致表皮發(fā)育不全、細胞過度凋亡，且轉(zhuǎn)錄組變化有限。對比7 J/cm?/天照射下加氫氣與不加氫氣組發(fā)現(xiàn)，氫氣可調(diào)控UVA誘導(dǎo)的生物學(xué)過程與信號通路，包括NRF2介導(dǎo)通路、NFκB1–RelA介導(dǎo)通路，并抑制p53介導(dǎo)的細胞衰老通路。 結(jié) 論 本研究證實，在較低劑量UVA（7 J/cm?/天，總劑量21 J/cm?）照射下，人工皮膚僅出現(xiàn)輕微組織學(xué)改變，但可檢測到光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化。此外，氫氣可通過皮膚表面滲透，對UVA誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激與衰老發(fā)揮保護作用，提示其在預(yù)防光老化方面具有潛在價值。本研究為未來氫氣防治UVA誘導(dǎo)光老化的轉(zhuǎn)化研究提供了初步實驗依據(jù)。 1 引言 分子氫因可通過減輕氧化應(yīng)激，對缺血再灌注損傷等疾病發(fā)揮有益作用而備受關(guān)注，長期攝入也可能促進健康。氫氣可選擇性清除羥自由基（?OH）等高活性活性氧（ROS），并調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）、核因子κB（NF-κB）等氧化應(yīng)激相關(guān)基因。 日光中含量豐富的長波紫外線（UVA，320～400 nm）可穿透表皮與真皮層，通過誘導(dǎo)活性氧生成，引發(fā)深皺紋、皮膚松弛、粗糙、色素沉著等光老化表現(xiàn)。在皮膚組織中，單線態(tài)氧（?O?）、超氧陰離子（O??）是UVA誘導(dǎo)的主要活性氧；其中?O?在光老化中起主導(dǎo)作用，由O??衍生的過氧化氫（H?O?）與?OH也參與其中。因此，減少UVA誘導(dǎo)的活性氧、調(diào)控光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答，有助于預(yù)防光老化。 本團隊前期研究已證實，間歇性吸入1.3%氫氣可抑制小鼠模型中UVA誘導(dǎo)的光老化表型。另一方面，三維人工皮膚等體外皮膚替代物，已逐漸成為皮膚病學(xué)研究中替代動物實驗的重要工具。然而，該模型能否檢測光老化早期進展，以及氫氣對這些早期改變的作用，仍不明確。 本研究采用成熟的體外皮膚替代體系，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)分析，評估UVA誘導(dǎo)的光老化及氫氣的預(yù)防作用。 2 材料與方法 2.1 人工皮膚培養(yǎng)及UVA照射聯(lián)合氫氣處理 使用可通入1.3%氫氣的CO?培養(yǎng)箱，氣流由STEC PAC-P2系統(tǒng)調(diào)控。將人工皮膚置于無酚紅培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO?條件下常規(guī)培養(yǎng)1天。 將人工皮膚隨機分為6組：無UVA照射（U0）、7 J/cm? UVA照射（U7）、10.5 J/cm? UVA照射（U10.5），各組再分為不加氫氣（?）與加1.3%氫氣（+）亞組。更換培養(yǎng)基后，在超凈工作臺中以UVA光源按設(shè)定劑量照射，隨后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天，該過程重復(fù)3次。最后再培養(yǎng)1天，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)檢測。 圖1 實驗分組與時間線 實驗分組依據(jù)UVA劑量（0、7、10.5 J/cm?）及是否暴露于1.3%氫氣劃分。樣本接受3輪UVA照射，每輪照射后培養(yǎng)1天（5% CO?，含或不含1.3%氫氣）。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)分析前再額外培養(yǎng)1天。主圖中組織學(xué)分析使用U0_H2（?）、U7_H2（?）、U7_H2（+）組，RNA測序分析則包含所有組別。 2.2 組織學(xué)分析 末次UVA照射后，將人工皮膚繼續(xù)培養(yǎng)2天，用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、4 μm切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色；采用TUNEL試劑盒檢測凋亡細胞。免疫組化檢測增殖細胞核抗原（PCNA）、磷酸化組蛋白H2A.X（Ser139）、p53。抗體詳細信息見補充資料。 冰凍標本經(jīng)O.C.T.包埋、6 μm切片，采用二氫乙錠（DHE）熒光染料檢測O??，用膠原蛋白雜交肽標記膠原降解。使用虛擬切片系統(tǒng)、共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡采集圖像，并用ImageJ軟件分析。 2.3 RNA測序（RNA?Seq）分析 末次UVA照射2天后，將人工皮膚迅速液氮冷凍并于?80℃保存。使用NucleoSpin RNA Plus試劑盒提取總RNA，經(jīng)質(zhì)控篩選RIN≥7.0的樣本建庫。采用Oxford Nanopore平臺進行納米孔測序，使用MinION測序儀完成測序。 使用Guppy進行堿基識別，Minimap2將序列比對至GRCh38.p14參考基因組。采用iDEP1.1云平臺分析差異表達基因（DEGs），設(shè)定FDR＜0.1、倍數(shù)變化≥2為篩選標準。基于差異基因進行KEGG富集分析與IPA通路分析。 2.4 實時熒光定量PCR 以總RNA為模板，采用一步法TB Green試劑盒進行qPCR，以GAPDH為內(nèi)參，采用2^(-ΔΔCt)法計算相對表達量。引物信息見補充資料。 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 組織學(xué)與qPCR數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，采用單因素方差分析（ANOVA）及Holm?Sidak事后檢驗，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。RNA?seq采用DESeq2進行差異分析，使用Benjamini–Hochberg法校正p值，F(xiàn)DR＜0.1定義為差異表達基因。 3 結(jié) 果 3.1 UVA照射與氫氣對表皮形態(tài)的影響 預(yù)實驗顯示，10.5 J/cm?/天 UVA可誘導(dǎo)過度凋亡與表皮萎縮，因此重點觀察7 J/cm?/天 UVA及氫氣的作用。 U7組表皮上層可見核固縮，U0組與U7組表皮厚度無顯著差異，氫氣處理未顯著改變表皮厚度。各組凋亡細胞比例與PCNA陽性細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異，但U7組呈上升趨勢。 圖2 氫氣暴露對表皮變薄的影響 （a）HE染色人工皮膚光鏡圖；（b）表皮厚度定量分析；（c）TUNEL染色凋亡細胞；（d）凋亡細胞比例定量；（e）PCNA陽性增殖細胞免疫染色；（f）PCNA陽性細胞比例定量。 3.2 UVA照射與氫氣對差異表達基因及生物學(xué)功能的影響 RNA測序聚類分析明確鑒定出與皮膚功能相關(guān)的基因簇（簇5）。相同UVA劑量下對比顯示：U7+H?組與U7組間的差異基因數(shù)量最多。 與U0組相比，U7組中細胞應(yīng)激損傷、炎癥、腫瘤相關(guān)通路顯著上調(diào)；而氫氣處理后，這些UVA誘導(dǎo)上調(diào)的通路顯著下調(diào)。 圖3 全局基因表達及皮膚功能相關(guān)通路分析 （a）全局基因表達熱圖；（b）簇5前10位富集通路；（c）各組差異基因數(shù)量；（d、e）經(jīng)典通路氣泡圖；（f、g）IPA分析NRF2介導(dǎo)氧化應(yīng)激通路。 PCA圖顯示樣本聚類，火山圖展示效應(yīng)量與統(tǒng)計學(xué)顯著性。 3.3 氫氣對UVA照射人工皮膚NRF2介導(dǎo)氧化應(yīng)激通路轉(zhuǎn)錄組的預(yù)測作用 聚焦氧化應(yīng)激關(guān)鍵通路NRF2：與U0組相比，U7組NRF2信號及下游多數(shù)抗氧化相關(guān)基因顯著上調(diào)；而加入氫氣后，NRF2信號及下游抗氧化基因（SQSTM1、HMOX1、PRDX1、FTH1、GPX2、SOD、TXN、GSR、TXNRD1等）均下調(diào)。 3.4 細胞應(yīng)激標志物O??、γH2AX與p53的檢測 DHE標記的O??主要分布于表皮，各組表皮O??水平無顯著差異。 γH2AX為氧化應(yīng)激與細胞衰老相關(guān)DNA損傷標志物：與U0組相比，U7組γH2AX陽性細胞比例顯著升高，但氫氣處理組與未處理組無顯著差異。 p53核定位結(jié)果顯示：與U0組相比，U7組表皮p53陽性細胞核比例顯著升高；氫氣處理后該比例顯著降低。 圖4 氫氣對ROS介導(dǎo)DNA損傷及p53核定位的影響 （a）DHE標記O??；（b）熒光強度定量；（c）γH2AX免疫染色；（d）陽性細胞比例；（e）p53免疫染色；（f）陽性細胞比例。 4 討 論 本研究證實，間歇性1.3%氫氣處理可顯著改變UVA照射人工皮膚中光老化相關(guān)基因簇的轉(zhuǎn)錄組。 組織學(xué)上，7 J/cm?/天 UVA可同時促進凋亡與增殖，有助于維持表皮結(jié)構(gòu)，氫氣在此條件下無明顯形態(tài)學(xué)影響；而10.5 J/cm?/天 UVA則導(dǎo)致表皮變薄、過度凋亡，提示UVA對表皮形態(tài)的影響呈劑量依賴性。人工皮膚模型與動物模型對UVA及氫氣的應(yīng)答差異，可能與生物環(huán)境、氫氣遞送途徑有關(guān)：動物體內(nèi)氫氣可經(jīng)表皮滲透與全身循環(huán)作用，而人工皮膚僅能通過表皮滲透，且缺乏血管、神經(jīng)與免疫細胞，無法完全模擬在體皮膚。 轉(zhuǎn)錄組分析顯示，7 J/cm?/天 UVA誘導(dǎo)的差異基因最多，氫氣可逆轉(zhuǎn)UVA上調(diào)的細胞應(yīng)激、炎癥、腫瘤相關(guān)通路，同時激活DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激抑制相關(guān)通路；而高劑量10.5 J/cm?/天 UVA僅引起有限轉(zhuǎn)錄組改變。提示較低劑量UVA可在不造成明顯組織損傷的前提下，誘導(dǎo)顯著的光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。 盡管上游分析中NRF2活性預(yù)測無顯著差異，但氫氣可下調(diào)多數(shù)NRF2下游基因，同時抑制經(jīng)典NFκB1?RelA通路，提示氫氣可通過調(diào)控NF?κB通路發(fā)揮抗光老化作用。 本研究中O??與γH2AX無組間差異，可能與樣本采集時間點有關(guān)；而氫氣可顯著降低p53核轉(zhuǎn)位，提示氫氣可能通過調(diào)控p53介導(dǎo)的衰老通路，預(yù)防UVA誘導(dǎo)的光老化。 5 結(jié) 論 本研究采用人工皮膚模型證實：在較低劑量UVA（7 J/cm?/天，總劑量21 J/cm?）照射下，皮膚僅出現(xiàn)輕微組織學(xué)改變，但可檢測到明顯的光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化。氫氣可通過皮膚表面滲透，改善UVA誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激與衰老相關(guān)生物學(xué)過程，提示其在預(yù)防光老化方面具有潛在應(yīng)用價值。本研究為未來氫氣防治UVA誘導(dǎo)光老化的轉(zhuǎn)化研究提供了初步實驗基礎(chǔ) |
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