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? ? ? ?[背景]熱應激(HS)可導致機體重要臟器損傷甚至引起死亡,全身性炎癥反應是其主要原因之一.NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎癥小體在介導組織損傷引起的無菌性炎癥中起重要作用,但其在HS損傷中的作用及機制尚不清楚.[目的]探討NLRP3炎癥小體在HS小鼠系統性炎癥反應和多器官損傷中的作用.[方法]設立野生型C57BL/6雄性小鼠對照組,HS組,以及NLRP3敲除HS組(Nlrp3-/-HS組),每組8只.利用溫度(41.0±0.5)℃,濕度(65±5)的高溫環境模擬艙對HS組和Nlrp3-/-HS組小鼠進行HS.每隔15～20 min監測肛溫以及記錄一般精神身體狀況.當HS組小鼠肛溫均超過42.0℃,立即將兩組小鼠移至正常室溫環境,于室溫恢復4h,解剖三組小鼠.HE染色觀察小鼠肝 腦和腸組織的病理改變;采用ELISA試劑盒檢測各組的血清腫瘤壞死因子α (TNF-α),白細胞介素(IL)-1β和IL-6的水平;采用內毒素檢測試劑盒檢測血清內毒素水平;采用免疫印記法檢測腸閉鎖蛋白(Occludin),閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的表達水平,以及腦,和腸道組織NLRP3,半胱天冬酶(caspase)-1,IL-1β的蛋白表達水平.[結果]受熱90 min時,HS組小鼠的肛溫[(42.1±0.2)℃]高于對照組[(36.6±0.2)℃],Nlrp3-/-HS組小鼠肛溫[(40.1±0.7)℃]和體重減輕量[(1.3±0.2)g]低于HS組(P<0.05).HE染色顯示HS組小鼠的肝,脾,腦和腸組織有不同程度的損傷,而Nlrp3-/-HS組小鼠的各個組織病理損傷程度減輕.與對照組相比,HS組小鼠血清的TNF-α,IL-1β和內毒素水平均升高,腸道Occludin,ZO-1表達量降低,Nlrp3-/-HS組小鼠的IL-1β分泌量較HS組減少,腸道Occludin,ZO-1表達量增多(P<0.05);HS組小鼠腦,腸道組織的NLRP3,caspase-1,IL-1β蛋白水平與對照組相比升高(P<0.05), Nlrp3-/-HS組小鼠的NLRP3,caspase-1和IL-1β表達量較HS組降低(P<0.05).[結論]NLRP3炎癥小體活化參與了急性HS所致的系統性炎癥反應以及多器官功能損傷.

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? ?目的:建立熱應激下評價NLRP3炎癥小體活性的細胞模型與動物模型.方法:(一)細胞實驗.(1)確定熱應激激活NLRP3炎癥小體實驗條件為40℃,4 h.在此基礎上,建立熱應激下評價NLRP3炎癥小體活性的細胞模型.實驗分為四組:空白對照組,熱應激組,LPS組,LPS 熱應激組.各組給予相應處理后,收集細胞培養液上清,ELISA法測定炎癥因子IL-1β的濃度.提取各組細胞總蛋白,Western Blot法檢測NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達變化,包括NLRP3,pro-Caspase-1,ASC,p10和pro-IL-1β.(2)提取各組細胞total RNA,Real-Time PCR檢測NLRP3炎癥小體相關組分基因NLRP3,ASC,Caspase-1的表達變化.(二)動物實驗.(1)C57BL/6小鼠分為正常對照組,熱應激組,LPS組,LPS 熱應激組.熱應激組小鼠放入40℃高溫模擬倉(濕度60±5)中給予熱應激,LPS組小鼠腹腔注射LPS,LPS 熱應激組小鼠腹腔注射LPS 4 h后放入40℃高溫模擬倉(濕度60±5)中給予熱應激.以LPS 熱應激組小鼠瀕死時間為終止時間,然后取血制備血清,ELISA法測定IL-1β的含量.(2)同時取上述各組實驗動物的腦組織,提取各組腦組織總蛋白,Western Blot法檢測NLpro-IL-1β蛋白的表達(3)生存分析表明LPS 熱應激組動物生存時間較其它三組顯著降低(P0.05).結論:經LPS預處理后,熱應激可以激活小鼠原代腹腔巨噬細胞的NLRP3炎癥小體,促進NLRP3,pro-Caspase-1,ASC,p10和pro-IL-1β蛋白的表達,以及IL-1β的分泌;NLRP3,ASC和Caspase-1基因表達水平的上調.小鼠接受40℃熱應激后,血清IL-1β水平升高,腦組織中NLRP3,pro-Caspase-1和pro-IL-1β蛋白的表達上調.以上結果表明,LPS 熱應激在細胞水平和整體動物水平均可激活NLRP3炎癥小體.

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? ??研究背景與目的:心搏驟停是的臨床急危重癥之一,心肺腦復蘇作為其有效的救治手段,一直在不斷的改進,但心搏驟停患者的預后并未得到顯著的改善.心搏驟停心肺復蘇后的幸存者普遍存在不同程度的神經功能障礙.眾所周知,炎癥反應在腦缺血/再灌注損傷過程中扮演著至關重要的角色.然而,心搏驟停心肺復蘇后全身缺血/再灌注損傷過程中,腦缺血/再灌注損傷所致的炎癥反應機制尚不明確.細胞焦亡作為一種程序性死亡方式,已成為近年來研究的熱點.本研究旨在探討NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡在心搏驟停心肺復蘇后腦缺血/再灌注損傷過程中的作用及相關機制.方法:1.采用C57BL/6小鼠和NLRP3~(-/-)小鼠制備高鉀合并窒息心搏驟停心肺復蘇模型,根據復蘇后取材時間點的不同,將這兩種品系的小鼠分別分為復蘇前組,復蘇后2h組,復蘇后12h組和復蘇后24h組.評估這兩種小鼠的總體復蘇情況,并記錄各組小鼠的神經功能評分.通過免疫印跡法(Western blot,WB)檢測腦組織中NLRP3,炎性Caspase-1,細胞焦亡的執行蛋白GSDMD的表達.應用免疫熒光觀察復蘇后不同時間點海馬回區NLRP3和活,改善細胞形態,增強細胞貼壁能力和細胞活力,降低炎性因子水平,繼而顯著提高小鼠心肺復蘇后2h存活率,自主循環恢復率,自主呼吸恢復率,顯著縮短心肺復蘇后自主循環恢復時間和自主呼吸恢復時間,顯著改善小鼠心肺復蘇后的神經功能評分

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